Cultivo de Acanthamoeba spp. en agua apirógena / Acanthamoeba spp. culture in pyrogen-free water / Cultura de Acanthamoeba spp. em água apirogênica

Resumen El objetivo de este estudio fue evaluar el cultivo de cepas de Acanthamoeba spp. en agua destilada estéril apirógena de uso farmacéutico. Se utilizaron dos cepas de genotipo T4 [un aislamiento de encefalitis granulomatosa amebiana (EGA) y una ambiental] y cepas correspondientes a los genotipos T5 y T15. Los quistes de cada una de las cepas se sembraron en placas de Petri con agar no nutritivo con diferentes soluciones (agua destilada estéril apirógena uso médico para preparaciones inyectables, agua destilada filtrada, medio Page) y combinados con suspensiones de Escherichia coli. Las placas se incubaron a 37 °C y se monitorearon diariamente durante 15 días para la detección de trofozoítos. El crecimiento se evaluó mediante examen microscópico directo. Cada cultivo contó con cuatro repeticiones para cada una de las cepas (n=96). En conclusión, se hallaron diferencias estadísticamente significativas en el crecimiento de las cepas por día. Las cepas T5 y T4 (encefalitis amebiana granulomatosa) desarrollaron mayor cantidad de trofozoítos en el primer día respecto de la cepa T15 (H=16,42; p=0,001). En el agua apirógena con E. coli se obtuvo un crecimiento igual a la solución de Page con E. coli (H=24,64; p=0,0001). No se hallaron diferencias estadísticamente significativas en la cantidad de trofozoítos obtenidos en agua apirógena con E. coli y solución de Page con E. coli en la cepa T4 (EGA) (U=4; p<0,05) pero sí en la cepa T4 ambiental (U=0; p<0,05).

Abstract The objective of this study was to evaluate the culture of strains of Acanthamoeba spp. in sterile apyrogenic distilled water for pharmaceutical use. Two T4 genotype strains [one isolate of granulomatous amebic encephalitis (GAE) and one environmental], a T5 and T15 genotype strains were used. The cysts of each of the strains were seeded in Petri dishes with non-nutritive agar with different solutions (pyrogenic sterile distilled water for medical use for injectable preparations, filtered distilled water, Page medium) and combined with Escherichia coli suspensions. Plates were incubated at 37 °C and monitored daily for 15 days for the detection of trophozoites. Growth was assessed by direct microscopic examination. Each medium culture counted four replicates for each of the strains (n=96). Concluding, statistically significant differences were found in the growth of the strains per day. Strains T5 and T4 (granulomatous amebic encephalitis) developed a greater number of trophozoites on the first day compared to strain T15 (H=16.42; p=0.001). In apyrogenic water with E. coli, a growth equal to Page's solution with E. coli was obtained (H=24.64; p=0.0001). No statistically significant differences were found in the amount of trophozoites obtained in apyrogenic water with E. coli and Page's solution with E. coli in strain T4 (GAE) (U=4; p<0.05), but significant differences were found in the environmental T4 strain (U=0; p<0.05).

Resumo O objetivo deste trabalho foi avaliar o cultivo de cepas Acanthamoeba spp. em água destilada apirogênica estéril para uso farmacêutico. Foram utilizadas duas cepas de genótipo T4 [um isolamento de encefalite granulomatosa amebiana (EGA) e uma ambiental], e cepas correspondentes aos genótipos T5 e T15. Os cistos de cada uma das cepas foram semeados em placas de Petri com ágar não nutritivo com diferentes soluções (água destilada estéril apirogênica para uso médico para preparações injetáveis, água destilada filtrada, meio Page) e combinados com suspensões de Escherichia coli. As placas foram incubadas a 37 °C e monitoradas diariamente durante 15 dias para detecção de trofozoítos. O crescimento foi avaliado através de exame microscópico direto. Cada cultura contou com quatro réplicas para cada uma das cepas (n=96). Em conclusão, diferenças estatisticamente significativas foram encontradas no crescimento das cepas por dia. As cepas T5 e T4 (encefalite amebiana granulomatosa) desenvolveram maior número de trofozoítos no primeiro dia em relação à cepa T15 (H=16,42; p=0,001). Em água apirogênica com E. coli, foi obtido crescimento igual ao da solução de Page com E. coli (H=24,64, p=0,0001). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na quantidade de trofozoítos obtidos em água apirogênica com E. coli e solução de Page com E. coli na cepa T4 (EGA) (U=4; p%<0,05), mas sim na cepa T4 ambiental (U=0; p<0,05).

Resistencia compresiva del mineral trióxido agregado en combinación con lidocaína o clorhexidina 2 por ciento / Compressive strength of mineral trioxide aggregate in combination with 2 per cent lidocaine or chlorhexidine

El mineral trióxido agregado sigue siendo el material deelección para la reparación de perforación de furcas y formación radicular de dientes inmaduros. Su mejor comportamiento biomecánico se obtiene cuando es mezclado con agua destilada, no obstante, diversas investigaciones muestran la posibilidad de ser combinado con sustancias comoclorhexidina o incluso hipoclorito. Objetivo: Comparar la resistenciacompresiva (RC) del mineral trióxido agregado (MTA) combinado con agua destilada, lidocaína al 2 por ciento más epinefrina 1:80,000 y clorhexidina al 2 por ciento. Material y métodos: Estudio experimental de laboratorio in vitro. Se fabricaron 30 discos de MTA mezclados con las tres sustancias a comparar (n = 10), con un tamaño de 4 mm de diámetro x 6 mm de alto, envueltos con gasa húmeda y dejando fraguar por 72 horas a 37 oC al 100 por ciento de humedad. Posteriormente se midió la resistencia compresiva de las unidades muestrales en una máquina de ensayo universal (Shimadzu Scientific Instruments, INC. Columbia, NY, USA). Las muestras fueron comprimidas a una velocidad de 1 mm/min y la RC se registró en megapascales (MPa). El análisis estadístico se realizó a través de análisis de varianzas (ANOVA) de una vía en el paquete estadístico Stata™v.13.1 para Windows. Resultados: El grupo que tuvo mayor resistenciacompresiva fue al combinar con agua destilada (8.32 ± 3.62 MPa) seguido del grupo de lidocaína al 2 por ciento y epinefrina 1:80,000 (6.60 ± 3.42MPa), y por último el grupo de clorhexidina al 2% (5.15 ± 2.25 MPa).Conclusiones: Teniendo en cuenta los resultados arrojados del presente estudio es posible inferir que el MTA al combinarse con agua destilada sigue ofreciendo las mejores propiedades físicas, lo que sugiere mejor comportamiento clínico endodóncico. Sin embargo, al no detectar diferencias estadísticamente signifi cativas, es posible que otros materiales puedan ser considerados como agentes de mezcla...

Water and Physiological Saline to Prevent the Formation of P-Chloroaniline / Agua y Suero Fisiológico para Prevenir la Formación de Paracloroanilina

This study determined if p-chloroaniline (PCA) can be minimized by using distilled water and physiological saline solution following sodium hypochlorite but before chlorhexidine. Hypochlorite 5%, 0.5%, 0.05%, 0.005% and 0.0005% dissolved in 0.9% NaCl and in distilled water were mixed with 2% chlorhexidine for the formation of PCA. The PCA was determined using UV-VISIBLE spectrometry, with spectral curve was determined the wavelength of maximum absorption of PCA. Formed PCA absorbance was measured between 0.025%, 0.02%, 0.015%, 0.01%, 0.005% and 0.0025% hypochlorite and 2% chlorhexidine. 2% chlorhexidine and hypochlorite with physiological saline form a white precipitate which prevents the measurement of PCA. Colored PCA is formed with 0.05%, 0.005% hypochlorite aqueous dilutions and 2% chlorhexidine. The lwavelength of maximum absorption obtained was 470 nm and absorbance of PCA showed a linear decrease. 0.005% NaClO produces the least amount of PCA. The best solvent to prevent the formation of PCA during the interaction of sodium hypochlorite with chlorhexidine is distilled water.

Este estudio determinó si la p-cloroanilina (PCA) puede ser minimizada mediante el uso de agua destilada y solución salina fisiológica seguido de la aplicación de hipoclorito de sodio, previo a la aplicación de clorhexidina. Hipoclorito al 5%, 0,5%, 0,05%, 0,005% y 0,0005% fue disuelto en 0,9% de NaCl y en agua destilada se mezcló con 2% de clorhexidina para la formación de PCA. El PCA se determinó mediante espectrometría UV-Visible, y con curva espectral se determinó la longitud de onda máxima del PCA. La absorbancia del PCA formado se midió con 0,025%, 0,02%, 0,015%, 0,01%, 0,005% y 0,0025% de hipoclorito y 2% de clorhexidina. La combinación de 2% de clorhexidina e hipoclorito en solución salina fisiológica forman un precipitado blanco que impide la medición del PCA. El PCA coloreado es formado con 0,05%, 0,005% diluciones acuosas de hipoclorito y 2% de clorhexidina. La longitud de onda máxima obtenida fue de 470 nm y la absorbancia del PCA mostró una disminución lineal. NaClO al 0,005% produce menor cantidad de PCA. El mejor disolvente para evitar la formación de PCA durante la interacción de hipoclorito de sodio con clorhexidina es agua destilada.

Conservación de cultivos de hongos de importancia médica en agua destilada / Preservation of fungal cultures of medical importance in distilled water

Introducción: en la colección de cultivos de hongos patógenos del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí, como centro de referencia nacional, se conservan los agentes causales de las principales micosis humanas, con fines de diagnóstico, investigaciones y enseñanza de la microbiología médica. La conservación de cultivos fúngicos en agua destilada estéril o método de Castellani ha sido avalada como un método que garantiza porcentajes elevados de viabilidad, pureza y estabilidad de las cepas; esto unido a su bajo costo y sencillez, la convierte en una alternativa ventajosa para el mantenimiento de los microorganismos en muchos laboratorios. Objetivo: mostrar los resultados en la preservación en agua destilada estéril de las principales especies fúngicas que integran esta colección. Métodos: se evaluó la viabilidad, pureza y estabilidad de las principales características morfológicas y fisiológicas de 240 cepas de diferentes especies fúngicas pertenecientes a la colección, conservadas en agua destilada estéril. Resultados: de los cultivos, 80 por ciento se conservó en estado viable y sin contaminaciones. Los mejores resultados se obtuvieron en la preservación de los hongos productores de abundantes conidios (97 por ciento de recuperación) y las levaduras (83 por ciento), mientras que con los dermatofitos y hongos dimórficos fue de 69 y 68 por ciento, respectivamente. En 17 géneros, la recuperación de cepas viables fue superior a 60 por ciento, mientras que en 8 resultó de 100 por ciento. El tiempo de conservación fue de 15 a 20 años. Se implementó una base de datos en formato digital de la colección sobre plataforma web. Conclusiones: el método de Castellani es un método de elección para la conservación de cultivos fúngicos en laboratorios de recursos limitados

Introduction: causal agents of the main human myicoses have been preserved in the culture collection of pathogenic fungi at Pedro Kourí Tropical Medicine Institute, a national reference center, with the purpose of using them for medical microbiology diagnoses, research and teaching. Preservation of fungal cultures in sterile distilled water, or Castellani's method, has been endorsed as a method ensuring high rates of strain viability, purity and stability, low costs and great simplicity. It is therefore an advantageous alternative for the maintenance of microorganisms in many laboratories. Objective: present the results obtained from the preservation in sterile distilled water of the main fungal species included in the collection. Methods: an evaluation was conducted of the viability, purity and stability of the main morphological and physiological characteristics of 240 strains of different fungal species from the collection, which had been preserved in sterile distilled water. Results: 80 percent of the cultures had retained their viable status without any contamination. The best results corresponded to the preservation of fungi producing abundant conidia (97 percent recovery) and yeasts (83 percent), followed by dermatophytes (69 percent) and dimorphic fungi (68 percent). In 8 genera, recovery of viable strains was 100 percent, and in 17 it was above 60 percent. Preservation time was 15-20 years. A web-based digital database was created for the collection. Conclusions: Castellani's is the method of choice for the preservation of fungal cultures in resource-limited laboratories

Conservación de cultivos fúngicos de alto riesgo de Histoplasma y Cryptococcus / Preservation of high risk fungal cultures of Histoplasma and Cryptococcus

Introducción: las colecciones de cultivos microbianos son las encargadas de garantizar el material biológico requerido para el desarrollo de las ciencias biológicas. Entre los métodos de conservación de cultivos fúngicos, la inmersión en agua destilada, por su bajo costo y sencillez, constituye una ventajosa alternativa. Objetivo: evaluar la utilidad de este método de conservación en los cultivos fúngicos de Histoplasma y Cryptococcus. Métodos: se realizó una evaluación del estado de conservación de las especies de mayor riesgo biológico, pertenecientes a los géneros Histoplasma y Cryptococcus de la colección de cultivos de hongos del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Se analizaron 102 cepas conservadas en agua destilada, de las cuales 92 por ciento estaba preservado por más de 10 años. Resultados: los porcentajes de recuperación para H. capsulatum, C. neoformans y C. gattii fueron 64,3; 79,1 y 100 por ciento, respectivamente. Se demostró que este método de conservación resulta satisfactorio para cultivos fúngicos en laboratorios de recursos limitados. Se implementó sobre plataforma web una base de datos digital con la información de interés de la colección. Se hizo una valoración de la importancia del estricto cumplimiento de las medidas de bioseguridad para el trabajo de las colecciones, especialmente frente a patógenos de alto riesgo. Conclusiones: la conservación de cultivos de hongos en agua destilada es un método de gran utilidad en laboratorios de recursos limitados. El trabajo de las colecciones de cultivos debe considerarse una actividad imprescindible para enfrentar los nuevos retos del desarrollo de las ciencias biomédicas.

Introduction: culture collections are responsible for providing the microbial resources for development of biological sciences. Storage in distilled water is one of the easiest and least expensive method for long-term fungal preservation. Objective: to evaluate the usefulness of this preservation method in fungal culture of Histoplasma and Cryptococcus. Methods: the preservation condition of the highest biological risk species from Histoplasma y Cryptococcus genera, included in the fungal culture collection of "Pedro Kourí" Institute of Tropical Medicine in Havana, was evaluated in this study. One hundred and two strains stored in distilled water, 92 percent of which had been preserved for more than 10 years, were analyzed. Results: the percentages of recovered strains from H. capsulatum, C. neoformans and C. gattii were 64.3 percent; 79.1 percent and 100 percent respectively. This method of preservation proved to be satisfactory for fungal culture in labs with limited financial resources. A web-based database with interesting information about the collection was made. The importance of strict compliance with the biosafety measures in these collections, particularly with high risk pathogens. Conclusions: preservation of fungal cultures in distilled water is a very useful method for laboratories with limited resources. Culture collections should be assumed as an essential activity in order to solve increasing challenges in the development of biomedical sciences.

Establecimiento de una línea celular primaria a partir de huevos con embrión de Toxocara canis / Establishing a primary cell line from Toxocara canis embryonated eggs

Introducción. Toxocara canis es el segundo nematelminto más prevalente en perros a nivel regional y entre los tres más frecuentes en algunos países de la región. Debido a que la fuente de contaminación es el perro, éste se convierte en un nematodo con gran potencial zoonótico. Por esta razón, consideramos importante disponer de una línea celular de este helminto para el estudio de los aspectos básicos, así como para el desarrollo de técnicas diagnósticas. Objetivo. Obtener una línea celular primaria a partir de huevos con embrión de T. canis. Métodos. Los parásitos se extrajeron del intestino delgado de perros menores de un año. Las células embrionarias se obtuvieron mediante la embriogénesis de los huevos de los nematodos adultos, en cuatro diferentes medios; dos ricos en sustancias nutritivas, el tercero con formol al 1 % y el cuarto con agua destilada. Las células se obtuvieron mediante disociación mecánica de los huevos con embrión mediante la utilización de jeringas 30G. Resultados. El tiempo estimado de obtención de la línea celular fue de 15 días, en los que siete eran utilizados en la embriogénesis de los huevos. Las células respondieron positivamente a los métodos de crioconservación luego de dos días, e inclusive dos meses después, permitiendo fases de replicación de cuatro pases. Conclusiones. Se logró obtener una línea celular de T. canis a partir de huevos con embrión de este helminto. Esta línea celular ayudará al entendimiento de las relaciones patógenas, posibles blancos terapéuticos y para el desarrollo de métodos diagnósticos.

Introduction: Toxocara canis is the second most prevalent nemathelminthes in dogs at regional level and among the three most frequent in some countries in the region. Due to the fact that the dog is the contamination source, it becomes a nematode with a high zoonotic potential, so we consider it important to be able to use the cell line of this helminth to study the basic aspects, as well as the development of diagnostic techniques. Objective: To obtain a primary cell line from embryonated eggs of T.canis. Methods: The parasites were extracted from the small intestines of dogs under one year old. Embryonic cells were obtained by embryogenesis of the eggs secreted by adult worms in four different media; two were rich in nutrients, one was 1% formaldehyde, and the other was distilled water. The cells were obtained by mechanical dissociation of embryonated eggs using 30G needles. Results: The estimated time for obtaining the cell line was fifteen days, from which seven were used for egg embryogenesis. The cells responded positively to the cryopreservation methods after two days or even two months, allowing a replication phase with four passes. Conclusions: We managed to obtain a cell line from T. canis embryonated eggs. This cell line will help the understanding of pathogenic relationships, potential therapeutic targets and for developing diagnostic methods.

Pseudomonas spp. y Staphylococcus spp. de origen alimentario y su conservación en agua destilada / Pseudomonas spp. and Staphylococcus spp. of food origin and its conservation in distilled water

INTRODUCCIÓN: El agua destilada ha sido utilizada como medio de soporte para preservar cepas fúngicas, fundamentalmente por existir poca información sobre sus beneficios para mantener otros microorganismos. Con esta premisa, se decidió evaluar su utilidad para conservar bacterias, de origen alimentario, en la colección de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología. MÉTODOS: Un total de 12 cepas (seis pertenecientes a Pseudomonas spp. y seis a Staphylococcus spp.) fueron ensayadas. Los datos de viabilidad obtenidos durante el año de conservación fueron procesados con el paquete estadístico SPSS versión 11.5. El análisis estadístico incluyó el análisis de la varianza para la comparación de las medias del recobrado de viables para las variables tiempo de conservación y dilución, y el test de Scheffé de comparaciones múltiples post hoc para la discriminación de las medias. Fueron controladas las características fisiológicas y la respuesta a la tinción de Gram de las cepas. RESULTADOS: No se encontraron diferencias significativas entre los grupos microbianos conservados en agua destilada. Los factores tiempo de conservación y dilución ejercieron su influencia sobre el recobrado de los cultivos. Se obtuvo estabilidad en la recuperación de viables a partir de los siete días de estudio. Se manifestaron diferencias significativas respecto a las diluciones de mayor valor. Se obtuvo 100 por ciento de estabilidad en las características fisiológicas y en la respuesta a la tinción de Gram para todas las cepas. CONCLUSIONES: La conservación en agua destilada resulta adecuada para preservar las cepas de Pseudomonas spp. y Staphylococcus spp. aisladas de muestras de alimentos durante un año con una buena viabilidad.

INTRODUCTION: The distilled water has been used as a support means to preserve fungal strains, mainly due to lack of information on its benefits to maintain other microorganisms. Thus, authors assessed its usefulness to preserve bacteria of food origin in the collection of microbial cultures in the National Institute of Hygiene, Epidemiology and Microbiology. METHODS: A total of 12 strains (six from Pseudomonas spp and six from Staphylococcus spp) were assayed. Data on viability obtained during the year of conservation were processed using the SPSS statistical package version 11.5. The statistical analysis included that of variance to compare the means of recovery of viable for the following variables: time of conservation and dilution, the Scheffé's test of post hoc multiples comparisons for discrimination of means. The physiological characteristics and the response to Gram's tincture of strains were controlled. RESULTS: There were not significant differences among microbial groups conserved in distilled water. The factors time of conservation and dilution had influence on the recovery of the cultures. There was a good stability in vials recovery from the 7 study days. There were significant differences regarding the dilutions of a greater value. It was possible to obtain a 100 percent of stability in the physiological characteristics and in the response to Gram's tincture for all the strains. CONCLUSIONS: The conservation in distilled water is appropriate to preserve the strains of Pseudomonas spp and of Staphylococcus spp isolated from samples of foods during a year achieving a good viability.

Preservação de dermatófitos pela técnica da água destilada estéril / Preservation of dermatophyte fungi by sterile distilled water technique

Fifteen dermatophyte strains preserved by sterile distilled water technique during 11 years in the Fungus Culture Collectionof the Oswaldo Cruz Institute were evaluated in terms of viability and stability of morphological aspects. Of the total number of strains, 14 (93.3%) were viable and no pleomorphic alterations were detected. The distilled water technique showed effective forlong-term laboratory storage of dermatophyte strains.

Quinze cepas de dermatofitos estocadas pela tecnica da agua destilada esteril, por 11 anos, na Colecao de Culturas de Fungos do Instituto Oswaldo Cruz, foram avaliadas quanto a viabilidade e estabilidade dos aspectos morfológicos caracteristicos. Do total de cepas, 14 (93.3%) mantiveram-se viaveis e alterações pleomorficas não foram detectadas. A técnica da água destilada se mostrou efetiva na preservação de cepas de dermatofitos por longos períodos de tempo.